Opis

Tehničke karakteristike

Увођење производа

Назив производа	Цат. бр.	Спец.
2×СИБР Греен кПЦР Мастер Мик (Лов РОКС)	G3321-01	1 мЛ
	G3321-05	5×1 мЛ
	G3321-15	15×1 мЛ

Опис производа/Увод

Овај производ је посебан 2× премикс раствор за кПЦР реакцију коришћењем СИБР Греен И методе химерне флуоресценције. Садржи све кПЦР компоненте осим прајмера и ДНК шаблона, што може смањити оперативне кораке, скратити време додавања узорка и смањити вероватноћу контаминације. Основна компонента је генетски модификована топлотно активирана Так ДНК полимераза, која ефикасно блокира активност ДНК полимеразе и спречава неспецифично појачање на ниским температурама ефикасним везивањем моноклонских антитела за Так ДНК полимеразу. Так ДНК полимераза активирана топлотом има многе предности као што су висока специфичност и осетљивост на детекцију. Са реакционим пуфером оптимизованим за кПЦР, веома је погодан за кПЦР реакције високе специфичности и високе осетљивости. Овај производ је 2× претходно помешани реагенс који садржи оптималну концентрацију СИБР Греен И за кПЦР реакцију, која може да добије добру стандардну криву у широкој квантитативној области. Квантификација циљних гена је тачна, поновљива и поуздана.

Услови складиштења и руковања

Транспорт са мокрим ледом. Чувати на -20 степену без светлости, важи 12 месеци. Избегавајте циклус замрзавања/одмрзавања. Након одмрзавања, може се стабилно чувати на 4 степена месец дана без светлости.

Компонента

Компонента	G3320-01	G3320-05	G3320-15
2×СИБР Греен кПЦР Мастер Мик (Лов РОКС)	1 мЛ	5×1 мЛ	15×1 мЛ
Мануал	Један примерак

Протокол анализе/процедуре

Припрема пре експеримента

1. Апарат за ПЦР амплификацију у реалном времену;

2. Специјална реакциона цев или реакциона плоча за експеримент;

3. ПЦР прајмери (принципи дизајна референтних прајмера);

4. Микропипета и глава пипете (аутоклавирање);

Процедуре

1. Препоручите систем кПЦР реакције:

Компонента	20 μЛ ркн	50 μЛ ркн	Коначна концентрација
2×СИБР Греен кПЦР Мастер Мик (Лов РОКС)	10 μL	25 μL	1×
Форвард Пример (10 μМ)а	0.4 μL	1 μL	0.2 μM
Реверсе Пример (10 μМ)а	0.4 μL	1 μL	0.2 μM
Темплатеб	Променљива	Променљива	по потреби
Вода без нуклеазе	Додајте у 20 μЛ	Додајте у 50 μЛ

а. Обично се добар ефекат појачања може постићи са коначном концентрацијом од {{0}}.2 μМ. Када је учинак реакције лош, концентрација прајмера се може подесити у опсегу од 0.2-1.0 μМ.

б. Количина додатка шаблона варира у зависности од броја копија циљног гена у раствору шаблона, а одговарајућа количина додатка шаблона се разматра разблажењем у градијенту. Најбоља додана количина ДНК шаблона у реакционом систему од 20 μЛ била је мања од 100 нг. Када је цДНК (РТ реакциони раствор) РТ-ПЦР реакције коришћен као шаблон, количина додатка не би требало да прелази 10% укупне запремине ПЦР реакционог раствора.

2. Поступак ПЦР реакције (може се подесити према инструментима):

А. Метода у два корака *					Б. Метода у три корака *
Стаге	Корак	Циклуси	Температура	Време	Стаге	Корак	Циклуси	Температура	Време
Фаза 1	Предегенерација	1	95 степени	30 сец	Фаза 1	Предегенерација	1	95 степени	30 сец
2. фаза	Дегенерација	40	95 степени	15 сец	2. фаза	Дегенерација	40	95 степени	15 сец
	Аннеалинг-Ектенсион		60 степени	30 сеца		Жарење		55-65 степен	10 сец
	Аннеалинг-Ектенсион		60 степени	30 сеца		Продужетак		72 степена	30 сеца
Фаза 3	Крива топљења	1	Подразумевана подешавања инструмента		Фаза 3	Крива топљења	1	Подразумевана подешавања инструмента

*: Ако је потребно побољшати специфичност амплификације, може се користити поступак у два корака или температура жарења; Да би се побољшала ефикасност амплификације, може се користити процедура у три корака или продужење времена.

а: За прикупљање флуоресцентног сигнала, подесите експериментални поступак према упутству за употребу инструмента.

Напомена

1. Пре употребе лагано помешати наопако. Немојте ковитлати и трести да бисте избегли мехуриће. Добро промешајте реагенсе пре употребе.

2. Реагенсе треба ставити на лед када се припрема реакциони раствор.

3. Производ садржи флуоресцентну боју СИБР Греен, тако да треба избегавати јако светло када се припрема ПЦР реакциони раствор.

4. Користите нову главу за једнократну употребу за припрему и паковање реакционог раствора како бисте избегли контаминацију између узорака.

5. Избегавајте поновно замрзавање-одмрзавање Мастер Микса и покушајте да га употребите у року од месец дана након одмрзавања.

Компатибилност

Марка ПЦР машине	G3320 (нема РОКС)	G3321 (низак РОКС)	G3322 (висок РОКС)
АБИ Тхермо лифе	ПикоРеалТМ Цицлер	7500/7500 брзо, ВииА 7™ КуантСтудио™ серија	5700/7000/7300/7700/7900/ 7900ХТ/7900 ХТ Фаст,СтепОне™,СтепОне Плус™
Стратагене		Мк3000П®/3005П™/4000™
Био-Рад	Све серије
Епендорф	Реалплек 2с, Мастерцицлер®еп реалплек
ИИИумина	Ецо КПЦР
Цефеида	СмартЦицлер®
Киаген Цорбетт	Ротор-Гене® серија
Роцхе	ЛигхтЦицлер™ серија
Такара	Тхермал Цицлер Дице серија
Аналитикјена	кТОВЕР серија
кТОВЕР	ЛинеГене серија

Принципи дизајна прајмера

1. Препоручује се да дужина производа за појачавање буде између 80-300 бп;

2. Дужина прајмера: 18-25 бп;

3. Садржај базе Г+Ц у прајмерима треба да буде између 40%-60%;

4. Разлика вредности Тм између прајмера унапред и обрнутог прајмера је мања од 2 степена, а вредност Тм између 58-62 степена је најбоља;

5. Случајност базне расподеле;

6. Боље је да прајмери не садрже самокомплементарне секвенце, иначе ће формирати секундарну структуру укосница;

7. Између два прајмера не би требало да постоје више од 4 комплементарне или хомологне базе, иначе ће се формирати димер прајмера, посебно комплементарно преклапање на 3' крају;

8. Предлаже се да је 3' терминална база прајмера Г или Ц;

9. У резултатима НЦБИ поређења нису пронађени други неспецифични производи.

Решавање проблема

Опис проблема	Могући разлози	Решења
На крају реакције није се појавила крива амплификације или се ЦТ вредност појавила прекасно	Концентрација шаблона је прениска	Поновите експеримент да смањите вишеструко разблаживање шаблона и почните од највеће концентрације када је концентрација узорка непозната
	Деградација шаблона	Шаблон је поново припремљен и експеримент је поновљен
	У систему постоје ПЦР инхибитори	Генерално, шаблон се уноси, повећава се однос разблажења шаблона или се шаблон високе чистоће поново припрема и понавља
	Прајмери могу деградирати	Прајмере који нису коришћени дуже време треба прво испитати на интегритет ПАГЕ електрофорезом да би се искључила могућност деградације
	Ниска ефикасност појачања	Повећајте концентрацију прајмера, испробајте процедуру амплификације у три корака или редизајнирајте прајмер
	Производ за појачавање је предугачак	Дужина производа амплификације је контролисана у опсегу од 80-300 бп
Празна контрола приказује сигнал	Загађење реакционог система	Прво треба заменити празну контролну воду. Ако се иста ситуација и даље догоди, треба заменити прајмере, аспираторе и ПЦР епрувете или започети нови Мастер Мик. Реакциони систем је припремљен у супер чистом столу како би се смањило загађење аеросолом
Празна контрола приказује сигнал	Појављује се неспецифична амплификација као што су димери прајмера	Генерално, нормално је да се производи амплификације појаве у слепој контроли након 35 циклуса, које треба анализирати са кривом топљења. Редизајнирајте прајмер, прилагодите концентрацију прајмера или оптимизујте процедуру ПЦР реакције
Крива топљења има више врхова	Дизајн прајмера је лош	Нови прајмер је редизајниран у складу са принципима дизајна прајмера
	Концентрација прајмера је превисока	Смањите концентрацију прајмера на одговарајући начин
	Постоји геномска контаминација у цДНК шаблону	Екстраховани раствор РНК се дигестира коришћењем ДНК ензима, као што је дсДНасе, да би се уклонила геномска контаминација, или да би се дизајнирали трансинтронски прајмери
Слаба поновљивост експеримената	Грешка при додавању узорка је велика	Употреба прецизне пипете, са висококвалитетном усисном главом тачне пипете; Шаблон високог разблажења, додавањем шаблона велике запремине да би се смањила грешка узорковања; Реакциони волумен кПЦР-а је повећан
	Концентрација шаблона је прениска	Поновите експеримент да смањите време разблаживања шаблона
	Одступање температуре на различитим локацијама кПЦР инструмента	Редовно калибришите кПЦР инструмент
Крива појачања није глатка	Флуоресцентни сигнал је преслаб, произведен након корекције система	Уверите се да се боје претходно помешане у Мастер Мику не разграђују; Замените флуоресцентни сигнал да бисте прикупили бољи кПЦР потрошни материјал
Крива појачања се ломи или клизи	Концентрација шаблона је била виша и почетна вредност крајње тачке била је већа од ЦТ вредности	Основна крајња тачка (Цт вредност -3) је смањена и подаци су поново анализирани
Криве појачања појединачних Велса су изненада нагло опали	У реакционој цеви постоје мехурићи	Уверите се да је МИКС потпуно растворен и да се не врти и не осцилује равномерно; Након додавања узорка, мехурићи се уклањају центрифугирањем са лаком еластиком. Време предденатурације је продужено на 10 мин да би се уклонили мехурићи

Само за истраживачку употребу!

Popularne oznake: 2×сибр греен кпцр мастер мик (лов рок), Кина 2×сибр греен кпцр мастер мик (лов рок) произвођачи, добављачи, фабрика

2×СИБР Греен КПЦР Мастер Мик (Лов РОКС)