Цалцеин АМ

 

Назив производа	Цат.бр.	Спец..
Цалцеин АМ	Г1728-0.1МЛ	0.1 мЛ

 

 

Калцеин АМ (Цалцеин ацетоксиметил естар), заснован је на Калцеину са увођењем ацетоксиметил естарске (АМ) групе, која повећава хидрофобност, тако да може лако да продре у мембрану живих ћелија. Калцеин АМ је сам по себи ћелијски пермеабилно, нефлуоресцентно и хидрофобно једињење које се по уласку у ћелију хидролизује ендогеним естеразама у ћелији да би произвео снажно негативно наелектрисан поларни молекул Калцеин који не може да продре кроз ћелијску мембрану, па је задржан унутар ћелије, док калцеин (максимална таласна дужина ексцитације: 494 нм максимална таласна дужина емисије: 517 нм) може емитовати јаку зелену флуоресценцију. У поређењу са другим сличним сондама (нпр. БЦЕЦФ АМ и ЦФДА АМ), Цалцеин АМ је тренутно једна од најидеалнијих флуоресцентних сонди за бојење живих ћелија због своје веома ниске цитотоксичности, практично без утицаја на ћелијске функције као што су пролиферација ћелија или хемотаксија лимфоцита, и ниска пХ осетљивост.

Због недостатка естеразе у мртвим ћелијама, Цалцеин АМ се користи само за тестирање одрживости и краткотрајно обележавање живих ћелија. Црвена флуоресцентна боја нуклеинске киселине пропидијум јодид (ПИ) не продире у ћелијску мембрану живих ћелија, она пролази кроз неуређени део мембране мртве ћелије до језгра и уграђује се у двоструку спиралу ДНК ћелије да би произвела црвену флуоресценцију ( ексцитација: 535 нм, емисија: 617 нм), дакле ПИ мрље само мртве ћелије. Калцеин АМ се често користи у комбинацији са пропидијум јодидом (ПИ) за истовремено двоструко флуоресцентно бојење живих и мртвих ћелија. Пошто и калцеин и ПИ-ДНК могу бити узбуђени на 490 нм, живе и мртве ћелије могу се истовремено посматрати флуоресцентном микроскопијом. Са ексцитацијом од 545 нм, могу се посматрати само мртве ћелије.

Калцеин АМ се може користити у већини ћелија сисара. Показало се да се Цалцеин АМ може користити у неким биљним ћелијама као што су ћелије налик маргинама корена Арабидопсис и неким квасцима као што су Пицхиа аномала и Саццхаромицес церевисиае. Одређени паразити као што је Леисхманиа не могу да уђу у живе ћелије због компоненти ћелијске мембране, али Цалцеин АМ може да уђе у ћелије паразита у раним фазама апоптозе, и стога се користи заједно са ПИ за детекцију паразита у раним фазама апоптозе. Цалцеин АМ није погодан за употребу на гљивама и бактеријама јер имају ћелијске зидове који спречавају Цалцеин АМ да уђе у ћелије.

Калцеин је сам по себи индикатор комплексирања метала, а флуоресцентни сигнал се гаси када се комплексира са металним јонима као што је Цо.²⁺, Ни²⁺, Цу²⁺, Фе³⁺, и Мн²⁺на физиолошком пХ, чинећи Цалцеин АМ такође зеленом флуоресцентном сондом која се може користити за одређивање прелазних пора митохондријалне пермеабилности.

Овај производ, Цалцеин АМ, је високе чистоће и растворен је у анхидрованом ДМСО у концентрацији од 2 мМ. Уобичајена коначна концентрација Цалцеин АМ је 0.1-5.0 μМ. Да бисте добили пожељнији резултат, прилагодите коначну концентрацију Калцеина на одговарајући начин према врсти ћелија и стварној ситуацији експеримента.

 

 

-20 степен за складиштење и транспорт, важи 12 месеци.

 

 

Компонента	G1728-0.1 мл
Цалцеин АМ	0.1 мЛ
Мануал	1 ком

 

 

Припремљен је радни раствор за бојење Цалцеин АМ:

Разблажите производ одговарајућим пуфером, као што је медијум за културу без серума, ХБСС (Г4203) или ПБС (Г4202), да бисте припремили радни раствор за бојење Цалцеин АМ у концентрацији од 0.1-5.0 µМ.

Напомена: Препоручује се да се коначна концентрација Цалцеин АМ прилагоди на одговарајући начин према типу ћелије и експерименталној реалности.

 

Процедуре

1. Тест флуоресцентне микроскопије или тест флуоресцентне зимографије за ћелије суспензије:

а) Ћелије су пребројане након одређених третмана према експерименталном дизајну. Узмите одговарајуће ћелије и центрифугирајте их на 250×г 5 минута на собној температури, одбаците супернатант и додајте одговарајућу запремину радног раствора за бојење Цалцеин АМ да би се густина ћелија учинила око 1×10⁶/мл.

б) Инкубирајте ћелије на 37ºЦ 30-45 мин, оптимално време инкубације је различито за различите ћелије. Узмите у обзир 30 минута као почетно време инкубације и оптимизујте га у складу са специфичном експерименталном ситуацијом да бисте добили идеалније резултате детекције.

ц) На крају инкубације, центрифугирајте на 250×г током 5 минута, аспирирајте супернатант и полако ресуспендујте ћелије додавањем претходно загрејаног медијума за културу на 37ºЦ.

д) Поновите корак ц два или више пута да бисте адекватно опрали и уклонили заостали раствор бојења.

е) Замените свеж на 37ºЦ претходно загрејан медијум за културу и инкубирајте на 37ºЦ још 30 минута даље од светлости да бисте осигурали да интрацелуларне естеразе довољно хидролизују Цалцеин АМ да произведу Калцеин са зеленом флуоресценцијом.

ф) Ћелије су центрифугиране на 250×г током 5 минута на собној температури, већи део медијума за културу је аспириран, а ћелије су ресуспендоване са преосталим медијумом за културу и размазане, а затим посматране под флуоресцентним микроскопом или детектоване флуоресценцијом зимографија. Максимална таласна дужина ексцитације Цалцеина је 494 нм, а максимална таласна дужина емисије је 514 нм. Ако је потребно, може се извршити и друго флуоресцентно бојење, а цео процес треба избегавати светлосном операцијом.

 

2. Флуоресцентни микроскопски тест адхерентних ћелија или тест обележавања флуоресцентног ензима:

а) Ћелије су инокулисане на петријевим посудама, плочама за културу ћелија са више јажица или ћелијским пузалицама и третиране на одређене начине у складу са експерименталним дизајном.

б) Аспирирајте раствор културе и исперите ћелије 1-2 пута ПБС-ом.

ц) Додајте одговарајућу количину Цалцеин АМ раствора за бојење и лагано протресите тако да боја равномерно покрије све ћелије. Генерално, запремина 96-плоче за бунар је 100 ул по бунарчићу, 24-плоче за бунар је 250 ул по бунарчићу, 12-плоче за бунар је 500 ул по бунарчићу и 6- плоча за бунар је 1 мл по бунарчићу.

д) Инкубирајте на 37ºЦ 30-45 мин, оптимално време инкубације варира за различите ћелије. Узмите 30 минута као почетно време инкубације и оптимизујте време инкубације у складу са ћелијама које се користе да бисте добили идеалнији ефекат бојења.

е) На крају инкубације, медијум културе је замењен свежим претходно загрејаним медијумом за културу на 37ºЦ и инкубиран на 37ºЦ још 30 минута даље од светлости да би се осигурало да је интрацелуларна естераза довољно хидролизована Цалцеин АМ да произведе Калцеин са зеленом флуоресценцијом .

ф) Аспирирајте течност културе, исперите ПБС 2-3 пута, а затим додајте течност ћелијске културе без серума која се може посматрати под флуоресцентним микроскопом или детектовати маркером флуоресцентног ензима. Калцеин има максималну таласну дужину ексцитације од 494 нм и максималне таласне дужине емисије од 514 нм, а може се даље бојати другим флуоресцентима по жељи, држећи цео процес даље од светлости.

 

3. Тест проточне цитометрије:

а) Након дигестије адхерентних ћелија трипсином, ресуспендујте ћелије у медијуму културе, суспендујте ћелије за директну употребу, пребројите, центрифугирајте одговарајућу количину ћелија на 250×г 5 минута на собној температури, одбаците супернатант и додајте одговарајући запремину радног раствора за бојење Цалцеин АМ тако да ћелије представљају једноћелијску суспензију и да густина ћелија буде приближно 1×106 /мл, са запремином од 1 мл за сваки узорак. НАПОМЕНА: Неопходно је припремити узорак ћелија који садржи само пуфер за употребу као негативну контролу у тесту проточне цитометрије. негативну контролу за тест проточне цитометрије, и пожељно је да овај пуфер остане исти као пуфер који се користи за припрему радног раствора за бојење Цалцеин АМ.

б) Инкубирајте 30 минута на 37ºЦ даље од светлости.

ц) Након што је инкубација завршена, ћелије су сакупљене центрифугирањем на 250 × г током 5 минута на собној температури. Додајте 1 мл пуфера по узорку, нежно ресуспендујте и сакупите ћелије центрифугирањем на 250 × г током 5 минута на собној температури. Напомена: Овај корак уклања вишак боје и реагенса који могу изазвати гашење флуоресценције.

д) Ресуспендујте ћелије са 400 µл пуфера. Даље бојење се такође може извршити ако је потребно. Имајте на уму да цео процес треба обавити далеко од светлости. Након бојења, узорци се стављају на лед и могу се детектовати проточном цитометријом и анализирати у року од 1 сата.

е) Имајте на уму да су узорци ћелија само пуфера и необојени коришћени за подешавање негативне контроле проточног цитометра. Калцеин има максималну таласну дужину ексцитације од 494 нм и максималну таласну дужину емисије од 514 нм.

 

 

1. Све флуоресцентне боје имају проблеме са гашењем, и мора се водити рачуна да се избегне светлост што је више могуће како би се успорило гашење флуоресценције.

2. Цалцеин АМ је веома осетљив на влагу и има тенденцију да се распадне у влажним срединама, стога Цалцеин АМ раствор мора бити добро затворен поклопцем након сваког повлачења. Препоручљиво је чувати у одвојеним затвореним паковањима према појединачној дози. Немојте користити врхове за пипете који садрже воду.

3. Пошто Цалцеин АМ није стабилан у воденим растворима као што је ПБС, радни раствор за бојење мора да се припреми и употреби сада.

4. Серум и фенол црвено у медијуму културе утичу на Цалцеин АМ бојење и препоручује се да се ћелије довољно оперу пре додавања Цалцеин АМ радног раствора.

5. Ћелије обележене калцеином АМ са уједначеном флуоресценцијом су добар избор за праћење ћелија и опште цитоплазматско бојење, међутим, не везују се ни за шта и могу се активно повући из ћелије у року од неколико сати, а задржавање калцеина у живим ћелијама зависи од инхерентних карактеристика типа ћелије и услова културе.

6. Калцеин АМ бојење не треба да буде праћено фиксацијом алдехида или ће се Калцеин изгубити током фиксације. Поред тога, сваки поремећај плазма мембране (нпр. средства за уклањање каменца или третман трипсином) довешће до цурења боје из ћелија.

7. Ако Цалцеин АМ има потешкоћа да уђе у ћелије, може се користити сурфактант као што је Плурониц Ф127. Уместо подлоге за културу може се користити и раствор Калцеина АМ у концентрацији 1/10.

8. Овај производ је ограничен на употребу у научним истраживањима од стране професионалаца и не сме се користити за дијагностичке процедуре или лечење, храну или лекове, нити се чува у обичном дому.

9. Ради ваше безбедности и здравља, носите лабораторијски мантил и рукавице за једнократну употребу.

 

Само за истраживачку употребу!

 

 

Popularne oznake: цалцеин ам, Кина цалцеин ам произвођачи, добављачи, фабрика