Брду Детецтион Кит

 

Назив производа	Кат.бр.	Спец.
Брду Детецтион Кит	G4102-50T	50T
	G4102-100T	100T

 

 

Овај производ БрдУ комплет за детекцију се користи за детекцију пролиферације ћелија ћелија и пресека ткива. БрдУ (5-бромо-2-деоксиуридин), тј. 5-бромодеоксиуридин, је аналог тимидина (Т). Принцип овог комплета је да се БрдУ може уградити у фазу синтезе ДНК (С фаза) кроз такмичење уместо тимидина т. Када се ћелије у снажној деоби помешају са БрдУ, ћелије које садрже БрдУ могу се детектовати коришћењем анти БрдУ антитела и лигазе антитела или флуоресцеина као индикаторског система. У комбинацији са другим ћелијским маркерима за двоструко обележавање, може се одредити тип и брзина пролиферације ћелија које се размножавају, што је од великог значаја за проучавање ћелијске динамике. БрдУ улази у ћелије ткива када се убризгава ин виво или узгаја у ћелијама. Локација уграђене ДНК је тачна, што може ефикасно да одражава ниво новосинтетизоване ДНК у ћелијама С-фазе. Штавише, на њега мање утиче унутрашње и спољашње окружење ћелија, а етикета се неће изгубити.

 

 

Превоз влажног леда; Раствор за разбијање мембране, раствор за блокирање (3% БСА) и 1 М ХЦл могу се чувати на 4 степена, 4% параформалдехида се може чувати на собној температури, а Анти-БрдУ (мишје мАб) треба да се чува на - 20 степен , са роком важења од 12 месеци.

 

 

Цомпонент Нумбер	Компонента	G4102-50T	G4102-100T
G4102-1	Решење за разбијање мембране	30 мЛ	30 мЛ
G4102-2	раствор за блокирање (3% БСА)	30 мЛ	30 мЛ
G4102-3	4% параформалдехида	30 мЛ	30 мЛ
G4102-4	1 М ХЦл	30 мЛ	30 мЛ
G4102-5	Анти-БрдУ (мишји мАб)	50 уЛ	50 уЛ
Протокол		1 ком

 

 

1. Припремите ПБС пуфер (препоручено г4202), секундарно антитело, градијент етанол, средство за заптивање, итд;

2. Припремите раствор за бојење језгра, а препоручује се раствор за бојење г1004 хематоксилином или раствор за бојење г1012 ДАПИ (тип спреман за употребу);

3. Припрема радног раствора анти БрдУ примарног антитела: разблажити анти БрдУ (мишје мАб) 100 пута са раствором за блокирање (3% БСА) да би се припремио радни раствор анти БрдУ примарног антитела, који је спреман за употребу и чува се на 4 степена;

4. Радни раствор секундарног антитела: припремите секундарно антитело против миша обележено ХРП (прати детекцијом белог светла, упарено са ДАБ комплетом за развој боје, препоручује се г1212) или флуоресценцијом (праћено детекцијом флуоресценције) у складу са потребама детекције и разблажите са ПБС-ом за припрему секундарног радног раствора антитела.

 

 

Узорци ћелија:

а. Припрема ћелије: унапред припремите делове за пењање ћелија како бисте обезбедили нормално стање ћелије и добру адхезију;

б. БрдУ инкубација: ћелије које садрже БрдУ се инкубирају у инкубатору одређено време у одсуству светлости. Концентрација БрдУ и време инкубације ћелије се разликују у зависности од типа ћелија. Предлаже се да се истраже најбољи услови у претходном експерименту. Експериментални услови тестираних ћелија у мерама предострожности су доступни за референцу;

ц. Фиксација ћелија: горе наведене ћелије инкубиране са БрдУ су испране три пута са ПБС по 5 мин сваки пут. Додајте 1 мл 4% параформалдехида на плочу са бунарима да покријете ћелије и фиксирајте на собној температури 20-30 мин. Исперите 3 пута са ПБС-ом по 5 мин сваки пут;

д. Пермеабилизација: додајте раствор за разбијање мембране на плочу са бунарима да покријете ћелије 8-10 мин, и исперите ПБС-ом 3 пута по 5 мин сваки пут;

е. Нуклеарно бојење (опционо):

У случају накнадне детекције беле светлости, језгра су обојена хематоксилином: додати раствор хематоксилинске боје у плочу са бунарима 5 мин на собној температури, усисати и одбацити раствор хематоксилинске боје и испирати са ПБС-ом 3 пута по 5 мин сваки пут;

У случају накнадне детекције флуоресценције, језгра су обојена ДАПИ: додати раствор ДАПИ боје у плочу са бунарима 5 мин на собној температури, усисати и одбацити раствор ДАПИ боје и испирати са ПБС три пута по 5 мин сваки пут;

ф. Поновна фиксација: додајте 4% параформалдехида у капима на плочу са бунарима, инкубирајте на собној температури 10 мин и исперите ПБС три пута по 5 мин сваки пут;

г. Закисељавање: додати 1 М ХЦл на плочу са бунарима да покрије ћелије, третирати их на 37 степени током 10 мин, и испирати их са ПБС три пута по 5 мин сваки пут;

х. После фиксације: поново додати 4% параформалдехида на плочу са бунарима, инкубирати 10 мин на собној температури и испрати са ПБС три пута по 5 мин сваки пут;

и. Блокирање: додајте раствор за блокирање (3% БСА) на плочу са бунарима и инкубирајте на собној температури 30 мин. Усисајте и одбаците течност за заптивање и немојте је чистити;

ј. Инкубација анти-БрдУ антитела: додајте радни раствор анти БрдУ примарног антитела на плочу са бунарима да покријете ћелије и инкубирајте преко ноћи на 4 степена. Усисајте и одбаците радни раствор примарног антитела против БрдУ и исперите га ПБС-ом 3 пута по 5 минута сваки пут;

к. Инкубација секундарног антитела: додати радни раствор секундарног антитела на плочу са бунарима да покрије ћелије и инкубирати на собној температури 1 х. Усисати и одбацити радни раствор секундарног антитела и испирати га ПБС-ом 3 пута по 5 минута сваки пут. Имајте на уму да ако се користи флуоресцентно обележено секундарно антитело, оно треба да буде заштићено од светлости током инкубације и прања;

л. Преглед заптивки и огледала:

За секундарно антитело обележено ХРП, користите ДАБ реагенс у боји (препоручено г1212) да бисте развили боју узорка ћелије, дехидрирали и учинили га транспарентним. Нежно подигните пењалицу шиљатом пинцетом, закопчајте га наопако на чистом стакалцу и запечатите за посматрање микроскопом;

За флуоресцентно обележено секундарно антитело, додајте средство за заптивање против флуоресцентног гашења (препоручено г1401) на чисто стакалце, нежно подигните стакалну плочицу шиљатом пинцетом, а затим га закопчајте на стакалцу ради заптивања и посматрајте флуоресцентним микроскопом;

 

Узорци секција ткива:

а. Припрема животиња: експерименталне животиње се припремају унапред и врши се обележавање БрдУ ин виво. Погледајте ГЦ310002-100мг. Након ин виво обележавања, узети су материјали, фиксирани и припремљени парафински пресеци према експерименталним потребама;

б. Секције парафина ткива су депарафинисане и рехидриране;

ц. Поправка: заокружите ткиво групним потезима, уроните делове у раствор за поправку антигена и загрејте их у микроталасној пећници. Референтни услови поправке: Гранц микроталасна пећница модел П70Д20ТЛ-П4 (називна улазна снага: 1180В; излазна снага микроталасне пећнице: 700В), коришћењем 1 × Трис-ЕДТА раствор за поправку антигена (пХ 8,0, спреман за употребу) (Бр. артикла Г1207), средњу топлоту 8 мин, прекините загревање 8 мин и окрените на средње ниску топлоту за 7мин. сврха поправке у микроталасној пећници је да кришке кључају 15 минута у раствору за поправку антигена. Сврха поправке у микроталасној пећници је да кришке кључају у раствору за поправку антигена 15 минута. С обзиром да снага микроталасних пећница различитих произвођача није иста, време до кључања није исто, а специфични услови поправке могу се оптимизовати у складу са разликом у снази микроталасних пећница. Природно хлађење;

д. Нуклеарно бојење (опционо):

У случају накнадне детекције белог светла, језгра су обојена хематоксилином: пресеци су обојени хематоксилином на собној температури 5 мин, и испирани ПБС-ом 3 пута по 5 мин сваки пут;

У случају накнадне детекције флуоресценције, језгра су обојена ДАПИ: раствор ДАПИ боје је додаван у капима у ткиво 5 минута на собној температури, раствор ДАПИ боје је изливен, а делови су испирани ПБС-ом 3 пута по 5 минута сваки пут. ;

е. Поновна фиксација: 4% параформалдехида је додато у капима у ткиво, инкубирано 10 мин на собној температури и испран три пута са ПБС-ом по 5 мин сваки пут;

ф. Закисељавање: 1 М ХЦл је додат у капима у пресеке да се покрију ткива, третирани на 37 степени током 10 мин, и испран три пута са ПБС-ом по 5 мин сваки пут;

г. После фиксације: поново додајте 4% параформалдехида у пресеке, покријте ткива, инкубирајте их 10 мин на собној температури и исперите их ПБС-ом 3 пута по 5 мин сваки пут;

х. Гашење ендогене пероксидазе (опционо): додајте 3% Х2О2 у секције и инкубирајте на собној температури 25-30мин да бисте уклонили ендогену пероксидазу. Након тога, секције су испране три пута са ПБС по 5 мин сваки пут;

и. Блокирање: додајте раствор за блокирање (3% БСА) у секције да покрије ткива и инкубирајте на собној температури 30 мин. Уклоните течност за заптивање и не чистите је;

ј. Инкубација анти-БрдУ антитела: додајте радни раствор анти БрдУ примарног антитела у пресеке да покријете ткива и инкубирајте на 4 степена преко ноћи. Радни раствор примарног антитела против БрдУ је уклоњен и испран три пута са ПБС по 5 мин сваки пут;

к. Инкубација секундарног антитела: додајте радни раствор секундарног антитела у делове да покријете ткива и инкубирајте на собној температури 1 х. Уклоните радни раствор секундарног антитела и исперите га три пута ПБС-ом по 5 минута сваки пут. Имајте на уму да ако се користи флуоресцентно обележено секундарно антитело, оно треба да буде заштићено од светлости током инкубације и прања;

л. Преглед заптивки и огледала:

Ако се користи секундарно антитело обележено ХРП, ДАБ реагенс у боји (препоручено г1212) се користи за развој боје пресека ткива, дехидратацију, транспарентност и микроскопско посматрање након заптивања;

За флуоресцентно обележено секундарно антитело, додајте средство за заптивање против флуоресценције (препоручено г1401) у капима и посматрајте са флуоресцентним микроскопом након заптивања.

 

Посматрање резултата

Када се детектују секундарним антителима обележеним ХРП, језгра су тамно плаве, а ћелије које се размножавају су смеђе. Ако је флуоресцентно обележено секундарно антитело, језгро показује плаву флуоресценцију (нпр.=358 нм, ЕМ=461 нм), а ћелија која се размножава је флуоресценција одговарајућег секундарног антитела.

 

 

1. За узорке који се пењу на ћелије, концентрација и време третмана БрдУ били су повезани са типом ћелије. Уопштено говорећи, концентрација и време потребно за лечење туморских ћелија су ниски. Ћелије са спором пролиферацијом, као што су фибробласти или епителне ћелије, треба да повећају концентрацију и продуже време деловања. Препоручени опсег концентрације је 20-100 μ М. Време деловања је 40 мин-4 х, које се може подесити према типу специфичних ћелија.

Следећа табела приказује најчешће коришћену концентрацију третмана ћелија и време за тестирање, само за референцу.

 

Целл	Концентрација БрдУ (μМ)	Време инкубације (мин)
A549	40	40
Хела	40	40
НРК{0}}е	40	40
СКОВ3	80	120
H9C2	40	40

 

2. Да би се обезбедио најбољи експериментални ефекат, препоручује се употреба других одговарајућих реагенса које производи наша компанија: раствор хематоксилинске боје (Г1004); ДАПИ раствор боје (Г1012); ДАБ комплет за развој боје (Г1212), средство за заптивање против флуоресценције (Г1401);

3. Ради ваше безбедности и здравља, носите лабораторијску одећу и рукавице за једнократну употребу.

 

Само за истраживачку употребу!

 

 

Popularne oznake: брду сет детецтион кит, Кина брду детецтион кит произвођачи, добављачи, фабрика